首先，DNA成為單鏈?zhǔn)且锟梢皂樌Y(jié)合的前提，如果沒有經(jīng)過充分的解旋，擴增效率肯定會大受影響（等溫擴增不在此列）。比如擴增cDNA變性大概10sec就夠，擴增質(zhì)粒則往往要30sec及以上。

其次，熒光探針需要先于引物結(jié)合到模板上，不論是水解探針還是蝎形探針。否則就會出現(xiàn)變性好的單鏈DNA在引物和酶的作用下都已經(jīng)補齊了另一條鏈了，探針還在一邊傻傻的說：“我沒上車啊~"

最后，常規(guī)的qPCR擴增片段一般在200bp左右，延伸時間設(shè)定30-45sec也基本夠用。至于說延伸溫度，多會把退火和延伸合并為一步，溫度采用60℃。但是有些反應(yīng)，因為整體的反應(yīng)優(yōu)化不太理想或者是反應(yīng)自身的一些固有限制，兩步法擴增的效果不夠好，此時可以使用三步法擴增，提高產(chǎn)物積累。采用三步法擴增時有個值得推敲的點，信號收集該是在退火階段還是延伸階段？染料法、水解探針、蝎形探針的答案并不一樣，可自行推導(dǎo)一番然后理論聯(lián)系實際驗證一下。